Molekularne biološke raziskovalne metode in njihova uporaba

Molekularne biološke raziskovalne metode igrajo pomembno vlogo v sodobni medicini, forenzične znanosti, in biologije. Zahvaljujoč napredkom v študiji DNA in RNA, oseba lahko razišče genom organizma določanje povzročitelja, priznati želeno nukleinsko kislino, v zmesi kislin itd

Molekularno biološke metode. Kaj je to?

Nazaj v 70-80s teh znanstvenikov je bil prvi razvozlati človeški genom. Ta dogodek je dal zagon za razvoj genskega inženiringa in molekularne biologije. Študij lastnosti DNK in RNK je pomenilo, da je sedaj mogoče uporabiti te nukleinske kisline za diagnozo bolezni, študije gena.

Priprava DNA in RNA

Z uporabo molekularnih bioloških diagnostične metode zahtevajo začetni material: Pogosto je to nukleinske kisline. Obstaja več načinov, da bi izbrali te snovi iz celice živih organizmov. Vsak ima svoje prednosti in slabosti, in ga je treba upoštevati pri izbiri metode za izolacijo nukleinskih kislin v čisti obliki.

1. Priprava DNA Marmur. Metoda temelji na obdelavo zmesi alkohola snovi, obori Nastalo čisto DNA. Slaba stran te metode je uporaba tokov, fenolom in kloroformom.

2. Izolacija DNA na tirnico. Glavna snov, ki se uporablja tu - je gvanidin tiocianat (GuSCN). To pospešuje odlaganje deoksiribonukleinske kisline v specializiranih substratov, iz katere se lahko nato zbrani s pomočjo posebnega pufra. Vendar GuSCN - je zaviralec TCP in celo majhen delež, ki dobi deponira v DNK lahko vplivajo na potek verižne reakcije s polimerazo, kar je pomembno pri delu z nukleinskih kislin.

3. Obarjanje nečistoč. Postopek se razlikuje od prejšnjih po tem, da so molekule same ne odlaga dehoksiribonukleinovoy kislino in nečistoče. Če želite to narediti, uporabite ionskih izmenjevalcev. Slabost je, da ne morejo vsi snovi poravnavo.

4. Mass pregled. Ta metoda se uporablja v primerih, ko ni treba imeti natančne podatke o strukturi molekule DNA, in potrebo, da bi dobili nekaj statistike. Razlog za to je, da se struktura nukleinske kisline lahko poškoduje pri rokovanju detergentov, zlasti Alkalies.

Uvrstitev raziskovalnih metod

Vsi molekularno biološke metode raziskav so razdeljene v tri glavne skupine:

1. Amplification (z množico encimov). To vključuje PCR - verižna reakcija s polimerazo, ki ima pomembno vlogo v mnogih diagnostičnih metod.

2. Neamplifikatsionnye. Ta skupina metod je povezana neposredno z delom zmesi nukleinskih kislin. Primeri 3 vrste odtise, hibridizacija in situ, itd

3. Metode, ki temeljijo na priznavanju signala iz molekule sonde, ki se veže na specifično sondo DNA ali RNA. Primer - hibridizacija sistem hibridne raztopina za prestrezanje sistem (HC2).

Encimi, ki jih lahko uporabimo v molekularno biološkimi metodami raziskovanja

Veliko molekularne diagnostični postopki vključujejo uporabo širokega spektra encimov. V nadaljevanju se najpogosteje uporabljajo:

1. restrikcijska - "cut" molekule DNA do potrebnih delov.

2. DNA polimeraze - sintetizira molekulo dvojno vijačnega deoksiribonukleinske kisline.

3. reverzne transkriptaze (reverzne transkriptaze) - uporablja za sintezo DNA iz predloge RNA.

4. DNA ligazo - je odgovorna za tvorbo fosfodiesterske vezi med nukleotidi.

5. eksonukleaza - odstrani nukleotide od končnih delov molekule deoksiribonukleinske kisline.

PCR - osnovni Postopek po pomnoževanju DNA

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) se pogosto uporablja v sodobni molekularne biologije. Ta metoda, pri kateri se posamezna molekula DNA lahko dobimo veliko število kopij (dopolnjevanjem molekule).

Glavne funkcije PCR:

- diagnosticiranje bolezni;

- kloniranje DNA segmente, Gene.

Za izvedbo verižne reakcije s polimerazo zahteva naslednje elemente: začetna molekule DNA, termostabilno DNA-polimerazo (Taq ali Pfu), deoksinukleotid fosfati (viri dušikovih baz), primerje (2 začetnih oligonukleotidov 1 molekulo DNA) in sam pufer sistem, ki lahko izvede vse reakcije.

PCR je sestavljen iz treh korakih: denaturacija, oligonukleotidni žarjenje in raztezek.

1. denaturacija. Pri temperaturi 94-95 stopinj Celzija proshodit prekinitev vezi vodika med obema verig DNA, in kot rezultat smo dobili dva enoverižnih molekule.

2. žarjena primerji. Pri temperaturi 50-60 stopinj Celzija pojavi pristopna primerje na koncih molekule enojnoverižne nukleinske kisline po vrsti dopolnjevanja.

3. Raztezek. Pri temperaturi 72 stopinj sintetiziramo hči dvojnoverižna molekule deoksiribonukleinske kisline.

DNA zaporedja

Z uporabo molekularnih bioloških metod raziskovalne pogosto zahtevajo poznavanje zaporedja nukleotidov v molekuli deoksiribonukleinske kisline. Za določitev genetske kode zaporedju. Molekularna diagnostika prihodnosti bo temeljila na znanju, pridobljenih pri določanju človeškega zaporedju.

Naslednje vrste zaporedja:

• Zaporedje, ki ga predlaga Maxam-Gilbert;
• Sanger zaporedja;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe zaporedja.